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口蹄疫滅活疫苗：背景、生產(chǎn)及其使用

 

張龍 李培林 任偉 謝文強(qiáng) 郭建軍 宋振文 賈英 謝雪岑 李春燕 劉艷霞
（金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙　呼和浩特　010030）
 
摘要：從疫苗上游的細(xì)胞培養(yǎng)到下游滅活乳化,分析了口蹄疫疫苗制造工藝的發(fā)展和變化,介紹了口蹄疫滅活疫苗歷史發(fā)展背景及其在口蹄疫防控中發(fā)揮的作用及今后的發(fā)展方向。
關(guān)鍵詞：口蹄疫；滅活疫苗；背景
 
1.   概述
口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）引起的牛羊豬等家畜嚴(yán)重的急性傳染病，由于其傳播快，給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重影響國(guó)際貿(mào)易，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須上報(bào)的疫病之一。FMD血清型眾多，包括O、A、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型 共7個(gè)血清型，血清型間無(wú)交叉保護(hù)，造成疫病控制難度較大。截至到2010年12月，全球FMD流行國(guó)家達(dá)60個(gè)，大多集中在亞非拉等發(fā)展中國(guó)家，給這些國(guó)家的畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)消極的影響，而因FMD貿(mào)易壁壘造成的畜產(chǎn)品出口損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疫病本身所帶來(lái)的動(dòng)物死亡的損失。世界各國(guó)都通過(guò)種種努力實(shí)現(xiàn)OIE認(rèn)定的“無(wú)FMD疫區(qū)國(guó)”地位，發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)撲殺等措施幾乎沒(méi)有FMD的流行，而南美洲一些國(guó)家通過(guò)免疫接種等措施實(shí)現(xiàn)了無(wú)FMD疫區(qū)或部分地區(qū)無(wú)疫區(qū)。歐洲上世紀(jì)90年代開(kāi)始實(shí)行不免疫策略,在疫情暴發(fā)時(shí)采用撲殺的手段控制FMD,但英國(guó)2001年FMD的爆發(fā)給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)社會(huì)造成巨大的損失，促使相關(guān)機(jī)構(gòu)開(kāi)始修訂FMD防控策略，2003年歐盟修訂了FMD防控策略，肯定了疫苗免疫在FMD爆發(fā)時(shí)的作用，隨后歐盟多個(gè)國(guó)家將疫苗免疫作為補(bǔ)充手段用于FMD的控制。滅活疫苗在歐美等地的FMD防制和根除中發(fā)揮了重要的作用，直到今天，滅活疫苗仍然是成功防控FMD的重要措施，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，F(xiàn)MD滅活疫苗在抗原生產(chǎn)、滅活、濃縮純化、乳化等方面不斷豐富和發(fā)展，在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)中已形成具有示范性的工業(yè)化生產(chǎn)體系。
目前，世界上FMD滅活疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用的主要有BEI滅活油佐劑疫苗和甲醛滅活鋁膠皂素疫苗，對(duì)于滅活疫苗的質(zhì)量控制上，更注重于疫苗的生物安全和免疫效力兩個(gè)方面，因此，近些年來(lái)，F(xiàn)MD研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)廠家將力量集中到抗原生產(chǎn)工藝、滅活劑選擇、濃縮純化、佐劑以及生產(chǎn)過(guò)程疫苗效力的替代檢驗(yàn)等關(guān)鍵技術(shù)的研究。
2.   FMD滅活疫苗歷史
縱觀FMD疫苗的研究和應(yīng)用歷史，F(xiàn)MD疫苗經(jīng)歷了滅活疫苗、活疫苗、滅活疫苗、新型疫苗這一歷史進(jìn)程和發(fā)展趨勢(shì)。而滅活疫苗從最初的舌皮組織毒經(jīng)甲醛滅活制成的疫苗到后來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)病毒經(jīng)BEI滅活制成疫苗，經(jīng)歷了20年的時(shí)間。FMD病毒抗原生產(chǎn)方式也主要有三種方式: 牛舌皮組織生產(chǎn)的Frenkel培養(yǎng)方法；轉(zhuǎn)瓶BHK21細(xì)胞單層培養(yǎng)法；BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，轉(zhuǎn)瓶單層培養(yǎng)方法是勞動(dòng)密集型生產(chǎn)方式，生產(chǎn)過(guò)程生物安全較難控制，容易散毒,而懸浮培養(yǎng)法屬于技術(shù)密集型生產(chǎn)方式，制備病毒抗原快速便捷，能很好的保持生產(chǎn)過(guò)程生物安全，是目前疫苗的主要生產(chǎn)方式。截止2011年年初,我國(guó)已有兩個(gè)國(guó)家指定口蹄疫疫苗企業(yè)采用了懸浮工藝生產(chǎn)口蹄疫疫苗。該工藝的推行勢(shì)必會(huì)給口蹄疫疫苗的生產(chǎn)甚至動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)的工藝帶來(lái)巨大革新，也勢(shì)必會(huì)促進(jìn)我國(guó)獸用疫苗質(zhì)量的巨大提升。有報(bào)道稱目前我國(guó)的口蹄疫疫苗質(zhì)量及檢驗(yàn)技術(shù)已達(dá)到世界水準(zhǔn)。
2.1組織舌皮毒
該方法制造的FMD滅活疫苗最早可追溯到上世紀(jì)20年代。1926年，法國(guó)科學(xué)家Vallee等發(fā)現(xiàn)FMD病毒經(jīng)甲醛滅活后，仍具有免疫原性，但工藝不好控制，滅活的病毒要么留有殘毒，要么失去了免疫原性。1939年，丹麥科學(xué)家Schmidt發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁膠體具有無(wú)毒性和免疫刺激的功能。1937年，德國(guó)科學(xué)家Waldmann首次將病毒的滅活與乳化引入到FMD疫苗生產(chǎn)中來(lái)，獲得了符合實(shí)際應(yīng)用的FMD疫苗-鋁膠甲醛滅活疫苗。
1947年，F(xiàn)renkel等首次采用牛舌上皮細(xì)胞培養(yǎng)FMDV獲得成功，為抗原的大量生產(chǎn)提供了經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的途徑，該疫苗在歐洲FMD防控中發(fā)揮了巨大的作用。但這種疫苗制苗材料來(lái)源不易,生產(chǎn)和應(yīng)用受到限制。
2.2 單層細(xì)胞培養(yǎng)毒
Frenkel等培養(yǎng)系統(tǒng)建立以后，組織培養(yǎng)學(xué)快速發(fā)展，原代細(xì)胞培養(yǎng)體系也迅速建立起來(lái)，1960年，利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系建立的牛腎細(xì)胞原代培養(yǎng)建立起來(lái)，緊接著，BHK21傳代細(xì)胞系得到了應(yīng)用，傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞具有較多的優(yōu)點(diǎn)。上個(gè)世紀(jì)60年代，人們就開(kāi)始采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)病毒，該工藝成熟度高，占地面積小，投資成本小等優(yōu)點(diǎn)，因此許多國(guó)家建立了規(guī)�；a(chǎn)工廠，截至到目前，我國(guó)仍然以該工藝為FMD疫苗主要生產(chǎn)方式。然而，該系統(tǒng)勞動(dòng)量大，生產(chǎn)過(guò)程難以保證生物安全和疫苗質(zhì)量批次不穩(wěn)定等因素，幾乎在發(fā)達(dá)國(guó)家停止應(yīng)用。1967年，人們利用微載體系統(tǒng)建立起了BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，在實(shí)驗(yàn)室的體系得到了批量化的生產(chǎn)。盡管如此，微載體由于其成本和系統(tǒng)的復(fù)雜性在FMD疫苗的應(yīng)用上沒(méi)有得到工業(yè)化應(yīng)用。
2.3懸浮細(xì)胞培養(yǎng)毒
1962年，人們發(fā)現(xiàn)BHK21細(xì)胞能全懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞在此體系中增值速度很快，在較短的時(shí)間便可以達(dá)到工業(yè)化量。1985年，這種體系被廣泛的用在FMD疫苗生產(chǎn)中。至今，世界上已經(jīng)有5000L的發(fā)酵罐在應(yīng)用。細(xì)胞在一定濃度的小牛血清和MEM培養(yǎng)基中，密度在2～3d即可增加到5×106個(gè)/ml或更高。懸浮培養(yǎng)在FMD疫苗生產(chǎn)中處于核心地位。1965年，生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)最早用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)，當(dāng)時(shí)的生物反應(yīng)器容積是30L。1983年，英國(guó)Wellcome公司就已能夠利用5000L的細(xì)胞罐大規(guī)模生產(chǎn)口蹄疫疫苗。目前，商品化的生物反應(yīng)器已經(jīng)可以達(dá)到20000L，大大提高了疫苗的生產(chǎn)效率和疫苗的質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。
懸浮系統(tǒng)的應(yīng)用，使無(wú)血清懸浮培養(yǎng)成為疫苗生產(chǎn)過(guò)程的主要工藝之一。通過(guò)用已知人源或動(dòng)物來(lái)源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，在實(shí)際生產(chǎn)不僅能夠減少生產(chǎn)中污染幾率，而且還能避免血清中潛在的一些病原微生物影響細(xì)胞培養(yǎng)或者對(duì)疫苗使用者造成威脅，也便于在生物反應(yīng)器中進(jìn)行代謝流分析，實(shí)施在線過(guò)程監(jiān)控，精確投料。無(wú)血清產(chǎn)品更加符合國(guó)際GMP要求，對(duì)我國(guó)FMD疫苗走向國(guó)際市場(chǎng)具有重要的現(xiàn)實(shí)和長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。
3.   FMD疫苗生產(chǎn)和使用中的關(guān)鍵要素
3.1病毒種子
一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)好的疫苗毒株應(yīng)該選擇流行株，但是流行株不一定能夠作為疫苗毒株來(lái)使用，首先疫苗毒株必須適應(yīng)細(xì)胞，保持其毒力、抗原性穩(wěn)定，而且其抗原譜必須廣，能夠保護(hù)大多數(shù)流行野毒的攻擊。因此，必須滿足上述條件的流行毒株才可以作為疫苗候選毒株。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，基因序列分析在病毒流行病學(xué)研究上的具有重要的作用，序列測(cè)定在評(píng)價(jià)疫苗株與流行毒株親緣關(guān)系方面具有重要的參考價(jià)值，然而這種方法對(duì)篩選疫苗候選毒株作用不大，在疫苗毒株的篩選中，應(yīng)更多的采用血清中和試驗(yàn)和阻斷ELISA方法，r值是評(píng)價(jià)疫苗株與流行毒株抗原關(guān)系的主要指標(biāo)。由于FMD容易發(fā)生變異，相關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)定期分析本國(guó)或本地區(qū)疫苗株與流行毒株的抗原關(guān)系，以期選擇適合的疫苗去防控FMD。
選定的毒株必須在單層細(xì)胞或懸浮細(xì)胞上連續(xù)傳代，以期達(dá)到穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)，病毒在不同種類和生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞適應(yīng)力是不同的，一般來(lái)說(shuō)，病毒在單層細(xì)胞上生長(zhǎng)的狀態(tài)要明顯的好于懸浮細(xì)胞，這種結(jié)果可能與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有直接的關(guān)系，這就要求病毒在制作種子批的時(shí)候，應(yīng)事先在單層上傳代，待病毒表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)再用傳代細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，在疫苗制造過(guò)程中，因傳代會(huì)導(dǎo)致毒株的變異，因此，應(yīng)盡量減少病毒的傳代次數(shù)，在研究和工業(yè)化生產(chǎn)中，應(yīng)建立規(guī)范的種子批制度，我國(guó)病毒的種子批分為原始種子批、基礎(chǔ)種子批和生產(chǎn)用種子批，基礎(chǔ)種子批毒種必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢驗(yàn)，由基礎(chǔ)種子批到疫苗成品的毒種代次應(yīng)不超過(guò)5代。
3.2細(xì)胞及用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
適應(yīng)于FMDV生長(zhǎng)的細(xì)胞除常用的BHK21細(xì)胞，還有IBRS細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，盡管BHK細(xì)胞來(lái)源于同一種組織，但是根據(jù)其傳代歷史，不同的細(xì)胞株對(duì)病毒的適應(yīng)能力是不同的，有的細(xì)胞對(duì)病毒敏感，有的細(xì)胞不敏感。根據(jù)世界疫苗制造工藝的發(fā)展趨勢(shì)，能較好適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，短時(shí)間內(nèi)大量增殖和支持病毒良好生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞系是FMD工業(yè)化生產(chǎn)所必需的。在細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)基的選擇優(yōu)化尤其是血清的類別對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和對(duì)病毒的敏感性尤為重要，需要具體技術(shù)人員不斷摸索、不斷選擇和優(yōu)化。
4.   疫苗生產(chǎn)關(guān)鍵過(guò)程控制
4.1細(xì)胞及病毒培養(yǎng)
能夠很好的支持病毒生產(chǎn)和穩(wěn)定傳代的細(xì)胞是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一，在現(xiàn)代FMD疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，一般采用BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)FMD疫苗。通常MOI為0.01即可在20h內(nèi)使90%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變。（MOI：感染比即1個(gè)感染單位/100個(gè)細(xì)胞使用）
4.2滅活及滅活檢驗(yàn)
病毒滅活及滅活檢驗(yàn)在FMD疫苗生產(chǎn)中是最關(guān)鍵的步驟之一，歷史上一些疫病的暴發(fā)與FMDV滅活不徹底有直接的關(guān)系。最早，人們采用甲醛滅活FMDV，甲醛通過(guò)病毒蛋白交聯(lián)而滅活病毒，對(duì)病毒核酸沒(méi)有改變，其滅活動(dòng)力曲線難以確定，難以確定病毒何時(shí)滅活完全。隨后，氮丙啶類如AEI被用于病毒滅活，該類滅活劑作用于病毒核酸，抗原蛋白不受破壞，能很好的保持病毒的免疫原性，但毒性較大。目前，BEI是FMD疫苗生產(chǎn)的主要滅活劑，這種化學(xué)試劑滅活病毒能繪制出清晰的病毒滅活曲線，符合一級(jí)滅活動(dòng)力曲線，對(duì)病毒安全，能保證病毒的抗原性，而且滅活徹底。對(duì)于不穩(wěn)定的疫苗株而言，采用甲醛和BEI共同滅活工藝能夠顯著降低滅活的時(shí)間，可由原來(lái)的40h降低到8h左右，而且更加安全。2008年出版的《OIE陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》中建議，F(xiàn)MDV滅活采用0.3mM BEI濃度2次滅活，一般來(lái)說(shuō)，為了徹底的滅活病毒，不使病毒逃逸，在工業(yè)生產(chǎn)中，一般要將一個(gè)滅活罐倒到另一個(gè)滅活罐。
滅活抗原的安全性通過(guò)敏感單層細(xì)胞或乳鼠傳代試驗(yàn)證實(shí)。將滅活的抗原液接種到單層細(xì)胞，連續(xù)傳代2-3代，無(wú)CPE；樣品接種乳鼠后，連續(xù)觀察7日，應(yīng)全部健活。10000L病毒懸液中的活病毒粒子應(yīng)少于1個(gè)。
4.3抗原濃縮和純化
滅活疫苗刺激有效的免疫應(yīng)答需要大量的抗原量，而且病毒增殖過(guò)程中的副產(chǎn)品如血清蛋白和病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白都會(huì)造成免疫動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)。因此，通過(guò)離心或沉淀等方法去除細(xì)胞碎片或者在接種病毒前將含血清培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒。
4.4乳化
乳化是為了提高疫苗的免疫原性，將滅活好的抗原與佐劑以一定比例混合。一般常用的免疫佐劑有氫氧化鋁膠、皂甙和油佐劑。最早采用的佐劑是氫氧化鋁膠佐劑，在抗原中加入氫氧化鋁佐劑，氫氧化鋁佐劑和皂甙用于FMD疫苗，該類疫苗能顯著的保護(hù)牛免受FMDV的攻擊，但對(duì)豬的免疫保護(hù)力相對(duì)較低，這種疫苗在中東和亞洲部分地區(qū)仍在使用。1945年，油佐劑開(kāi)始應(yīng)用于FMD疫苗，油佐劑疫苗對(duì)牛和豬均能產(chǎn)生良好的保護(hù)力，疫苗的免疫持續(xù)期長(zhǎng)，并且在其中加入Tween-80，降低疫苗的黏度，黏度小、穩(wěn)定性好和乳化簡(jiǎn)便的油佐劑一直在不斷的發(fā)展和改進(jìn)，如ISA206以及近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的“即用型”（Ready-to-use）油佐劑，將逐漸取代鋁膠和皂甙等傳統(tǒng)佐劑。
5.   疫苗質(zhì)量控制
疫苗的質(zhì)量控制是保證疫苗安全、有效的重要手段，在現(xiàn)代GMP條件具有重要的意義。好的疫苗不僅需要良好的毒株，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的原材料，控制抗原生產(chǎn)過(guò)程的抗原含量和病毒滴度，還要做好病毒的滅活工作和乳化工作，成品檢驗(yàn)中把好檢驗(yàn)，無(wú)菌檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)。
滅活疫苗誘發(fā)免疫應(yīng)答通常需要大量的抗原含量，而且疫苗中的非病毒蛋白常常引起過(guò)敏反應(yīng)，尤其在制造多價(jià)疫苗的時(shí)候，必須要對(duì)病毒抗原進(jìn)行純化濃縮，以達(dá)到增加抗原含量和減少疫苗變態(tài)反應(yīng)的目的。目前常用的濃縮方法有：1氯仿處理，2氫氧化鋁膠處理3超濾，4PEG處理。
抗原定量檢測(cè)技術(shù)補(bǔ)體結(jié)合（CF）試驗(yàn)、定量蔗糖梯度密度分析法等可以直接測(cè)量計(jì)算出抗原中完整口蹄疫病毒粒子146S的值（ng/ml）,從而定量配制疫苗。
FMD疫苗的效力試驗(yàn)，是通過(guò)PD50來(lái)表示，常規(guī)疫苗需至少達(dá)到3PD50，緊急接種疫苗需至少達(dá)到6PD50。目前，發(fā)到國(guó)家已經(jīng)采用本動(dòng)物替代方法檢測(cè)FMD疫苗的效力，該檢測(cè)方法也是我國(guó)FMD疫苗生產(chǎn)急需解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。
生產(chǎn)環(huán)境，生產(chǎn)較高質(zhì)量的疫苗必須有完全符合國(guó)家GMP要求的車間、硬件、設(shè)備、設(shè)施、檢驗(yàn)室、符合要求的動(dòng)物基地等。
質(zhì)量保證機(jī)構(gòu)：QA和QC及合格的供應(yīng)穩(wěn)定的供應(yīng)商。
6.   疫苗在FMD防控中的作用
滅活疫苗由于其可靠的安全性和良好的免疫效利，在FMD控制和消滅方面取得了成功并受到人們的廣泛承認(rèn)，由最初的感染動(dòng)物組織病毒制成的甲醛滅活疫苗到目前的懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒制成的油佐劑疫苗，使FMD疫苗制造成本更加廉價(jià)穩(wěn)定，到目前為止，F(xiàn)MD滅活疫苗無(wú)論從佐劑、滅活劑還是病毒抗原制備等方面均取得了很大的成就。但也有不足之處：對(duì)于有效的免疫，疫苗的抗原含量要保證，生物安全防護(hù)級(jí)別較高，滅活不完全可能導(dǎo)致散毒，另外，滅活疫苗的成本較高。
鑒于上述原因，在研制高質(zhì)量FMD疫苗時(shí)，除了選擇免疫原性好，廣普性強(qiáng)以及適應(yīng)病毒生長(zhǎng)的基質(zhì)外，還需要對(duì)病毒的免疫機(jī)理等作深入的研究分析，從疫苗制造的多個(gè)環(huán)節(jié)提高疫苗的安全性和免疫效力。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程疫苗是未來(lái)疫苗的發(fā)展方向，并已經(jīng)取得了一定的成果，然而，新型疫苗進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用，不僅需要對(duì)FMDV免疫機(jī)制和分子特性做深入的研究，還需一系列復(fù)雜的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等程序才能投入市場(chǎng)。時(shí)至今日，滅活疫苗仍然是FMD防控的主要物資，在疫病暴發(fā)時(shí)的緊急免疫具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，因此，進(jìn)一步從滅活疫苗生產(chǎn)工藝等方面改善疫苗的免疫效力和良好的生物安全防控仍具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，另外，F(xiàn)MD多價(jià)疫苗的使用也是FMD控制的主要趨勢(shì)。
參考文獻(xiàn)：
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